Transwell是检测细胞侵袭能力的检测方法

发布时间:2021-10-25 07:35:39

Transwell 是检测细胞侵袭能力的检测方法 我们所使用的是 Chemicon 公司的 ECM554,基质胶已经包被好了,买来就可以 用,很方便,而且我们算过,跟自己买胶来包被价格相差不大。这种胶 4 度下很 软,37 度则变得比较坚硬,因此用前应先放在培养箱中 10 分钟作用,使胶完全 凝固。 该试剂盒对穿过膜的细胞进行荧光染色,再用裂解液裂解细胞后检测荧光值。我 们在实际使用的时候对穿过膜的细胞采用 1%结晶紫染色,镜下计数细胞数目。 结晶紫也可以用 33%醋酸溶解,再用酶标仪 570nm 检测,同样可以反应穿过细 胞数 因为基质胶的厚度直接影响穿过膜的细胞数, 因此建议有条件的话还是买这类已 经铺好胶的试剂盒,比较可靠。 说明书该公司网上可以下载,对原理也有比较详细的阐述,可以去查一下。 我们做的时候,上室用 0.5%BSA 的培养液,下室用 5%血清的培养液,下室血 清的浓度可根据细胞类型的不同进行调整,如果细胞侵袭能力强,可适当降低血 清浓度,否则可适当提高血清浓度。 需要注意的是: 1。上室内的细胞数目要适当,过多,穿过膜的细胞会过多过快,如果用计数法 的话将难以计数;最少也要保证在收样的时候,上室内还要有细胞存在。具体细 胞密度需要自己摸索。 2。细胞计数的准确性对结果影响很大,各组间最好不要分开计数。尽量用同一 密度的细胞悬液给予不同处理,保证各组细胞量一致 3。对细胞的处理不可影响细胞生存。否则难以肯定是细胞量的改变还是侵袭能 力改变

侵袭小室其实不止是 transwell 的,其它像 Boyden chamber、Thincert 也 、 挺好用的。 挺好用的。我用过 Thincert,个人感觉不错,而且价格便宜,是 grelner 的,孔 径 8 微米用于 24 孔板的一个才 45 块人民币,而且可以零买,不想 transwell, 总是一箱一箱的卖,实在是太贵了! 侵袭实验要结合实验目的,不一定非要包被的。 下面奉上用 Thincert 做侵袭实验的步骤(摘自《A quantitative cell migration assay using ThinCert? cell culture inserts》 ,大家如需要,可用 google 搜之) : 1. Prepare cell cultures according to standard cell culture procedures 2. Starve cells overnight in serum-free medium with 0.2 % BSA 3. Harvest cells and wash them twice in PBS 4. Resuspend cells in serum-free medium with 0.2 % BSA to an appropriate final cell concentration (e.g. 106/ml) 5. Place 24 well ThinCertTM cell culture inserts in the wells of a CELLSTAR? 24 well cell culture plate 6. Add 600 l culture medium with or without chemoattractant to each well of the cell culture plate

7. Add 200 l cell suspension to each cell culture insert 8. Incubate the cell culture plate for 3-24 h in a cell culture incubator at 37°C and 5 % CO2 9. Remove the cell culture medium from each well of the cell culture plate and replace it by 450 l serum-free culture medium with 8 M Calcein-AM 10. Incubate for 45 min in a cell culture incubator at 37°C and 5 % CO2 11. Remove the culture medium from the cell culture inserts 12. Transfer the cell culture inserts into a freshly prepared 24 well cell culture plate containing 500 l prewarmed Trypsin-EDTA per well 13. Incubate for 10 min in a cell culture incubator at 37°C and 5 % CO2, agitate the plate from time to time 14. Discard the cell culture inserts and transfer 200 l of the Trypsin-EDTA solution (now containing the migratory cells) from each well into a black flat bottom 96 well plate 15. Read fluorescence in a fluorescence plate reader at an excitation wavelength of 485 nm and an emission wavelength of 520 nm 从第 9 步开始计数侵袭细胞时, 这份说明书用的是荧光标记, 但这种方法成本高 而且繁琐。我做的时候改为 giemsa 染色,发现效果不错,具体如下: 9.侵袭实验完成后,取出小室,用棉签小心将膜上表面的细胞擦拭去除; 10.用手术刀片小心沿小室边缘将膜切下; 11.把膜下表面向上放在一个洁净的 24 孔板的孔中; 12.甲醇:冰醋酸(3:1)固定 10min 后用 10%giemsa 染色; 13.在显微镜下随机选取 5 个视野计数细胞(即染成紫红色的点,未着色的多为 细胞碎屑)计数并拍照留念

Transwell 细胞体外侵袭实验
概述 目的:总结并改进细胞体外侵袭实验的操作经验。方法:采用改进后细 胞体外侵袭实验分别研究不同浓度 TNFα 刺激下的 HCCC29810 胆囊癌细胞 体外侵袭能力的强弱;粉防己碱对 HUVEC 人类脐静脉内皮细胞迁移能力的 抑制作用;VEGF 对人结肠癌 HT229 细胞体外侵袭能力的影响。结果:改进 后侵袭试验定位准确,结果清晰。结论:按照作者建议的方法操作,能够 缩短实验时间,有助于提高细胞体外侵袭实验的质量。 细胞体外侵袭实验 主要应用于各种细胞因子对恶性肿瘤细胞侵袭和转移的影响及一些抑制血 管生成的新药研究,但在具体实验中获得真实、最佳实验结果的图像,并借 以说明问题并非简单。很多研究人员在此方面花费了很多时间和科研经费, 从刺激实验用的细胞到苏木素染色,看似简单的实验步骤中有很多环节需 要研究者注意.

材料与方法 1. 1 Matrigel:Becton Dickinson Compary, - 20 ℃保存; Tanswell plate:Costar ,USA , # 3422 ,聚碳酯膜微孔直径为 8μm; 苏木素染液,梯度乙醇,二甲苯溶液。 1. 2 趋化因子的制备 取传代第二天长势良好的 NIH3T3 细胞,无血清 培养基轻柔漂洗两次; 加入无血清培养基,37℃,5 %CO2 培养 24 h~48h, 收集细胞培养上清;4 ℃,12 000rpm 离心,10 min ,取上清;0.22 μm 滤 膜过滤除菌;分装,在- 20 ℃保存。 1. 3 transwell 培养板准备 所有操作均需无菌操作。-20℃保存的 Matrigel 在冰上保 2℃~8℃过夜融化。在冰上用预冷的枪头吸取 100μl Matrigel 加入冰预冷的 300μl 无血清培养基中,充分混均。 取上述稀释的 Matrigel 25 μl 加入 transwell 板上室,覆盖整个聚碳酯膜,37 ℃,30 min , 使 Matrigel 聚合成胶。 已铺好 Matrigel 的 transwell 培养板置于 37℃可 保存 2 周。 1. 4 Matrigel 侵袭实验(Matrigel Invasion Assay)刺激后的各组细胞用 PBS 漂洗 3 次。以常规方法用无血清培养基制备单细胞悬液,5 ×105 个细 胞/ ml ,每组细胞各分为两部分。胎盘兰拒染实验,细胞活力需大于 95 %。 Transwell 培养板上室加入 100μl 细胞悬液( 5 ×104 个) 并加入无血清 培养基 200 ul 。 Transwell 培养板下室加入 500μl 趋化因子,37℃,5 %CO2 培养 24 h。用湿棉签轻轻擦去 Matrigel 凝胶和聚碳酯膜上表面的细胞。 小心取出上室,用线拴住,并做好标记,用冰预冷的甲醇固定 30 min。苏木素 染色 1 min。梯度乙醇脱水(80 % ,95 % ,100 %) ,二甲苯透明。小心将聚 碳酯膜自上室基底切取下来,置载玻片上中性树脂封片。附着于聚碳酯膜下 表面的细胞在高倍镜下( ×400) 随机取 6 个视野[1 ] 计数,取*均数。重 复实验两次。

注意事项 2. 1 NIH3T3 细胞制备的趋化因子与胎牛血清 趋化因子是能使细胞产生 趋化运动的一类细胞因子[2 ] 。目前利用 NIH3T3 细胞制备趋化因子做细 胞体外侵袭实验的实验室比较多,时间较长且实验步骤繁琐。众所周知,胎

牛血清中有趋化因子,我们在不同浓度 TNFα 刺激下的 HCCC29810 胆囊癌细 胞体外侵袭能力的强弱实验中发现用胎牛血清和用 NIH3T3 细胞制备的趋 化因子做细胞体外侵袭实验效果是一样的,两组迁移的细胞数很接*。在实 验时间上,用 NIH3 T3 细胞制备趋化因子做细胞体外侵袭实验周期为 1 周, 而用胎牛血清作趋化因子做细胞体外侵袭实验周期为 2 d ,实验时间节省了 很多。因此认为可以用胎牛血清来代替 NIH3T3 细胞制备的趋化因子。 2. 2 细胞的准备 所需细胞应处在对数生长期,细胞活力需大于 95 %。 如果细胞活力小,就会造成细胞穿透能力下降,影响实验结果。 2. 3 擦去 Matrigel 凝胶和聚碳酯膜上表面的细胞 先用干棉签将上 室内液体吸去,再用蒸馏水浸湿的棉签轻轻擦去 Mat rigel 凝胶和聚碳酯膜 上表面的细胞,如果没有擦净聚碳酯膜上表面的细胞,在细胞计数时就会将 没擦掉的细胞也*础S绕涫窍赴残蔚氖焙,就会分辨不出是穿过去 的细胞还是没穿过去的细胞,对于长梭形细胞来说,穿过去的细胞为长梭形, 没穿过去的细胞多为圆形。 2. 4 苏木素染色 上室浸泡在新苏木素中的时间为 1 min ,用过多次 的苏木素为 2 min。在研究粉防己碱对 HUVEC 人类脐静脉内皮细胞迁移能 力的抑制作用没有将多余苏木素洗去,直接脱水、透明,造成细胞图片背景 模糊,细胞不清楚。 在作不同浓度 TNFα 刺激下的 HCCC29810 胆囊癌细胞体 外侵袭能力的强弱实验时我们将其置于盛有自来水的烧杯中,反复漂洗几 次,将多余苏木素洗去再行脱水、透明;这样做出的细胞图片背景干净,细胞 清楚。 2. 5 脱水和透明时间 脱水时间各为 1 min ,在二甲苯中的时间不要 过长,以 2 min~3 min 为宜;尤其是同时操作多个样本时,时间过长就会造 成部分聚碳酯膜从上室基底部自动脱落下来,上室间粘连在一起,造成样本 混淆,实验失败。建议在最后一步实验时需二人协做,一人辨别并取出样本, 一人小心将聚碳酯膜自上室基底切取下来,置载玻片上中性树脂封片并及 时编号。 2. 6 细胞计数 当实验用的细胞为圆形时,实验人员容易将聚碳酯膜 上小孔误认为细胞进行计数。我们在作 VEGF 对人结肠癌 HT229 细胞体外 侵袭能力的影响时,发现 HT229 细胞很小,很容易将聚碳酯膜上小孔误认为 细胞进行计数 。


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